拓扑特肯诱导人口腔上皮癌细胞凋亡的机制

0引言

 

　　拓扑特肯(Topotecan, TPT)为9二甲基氨基10羟基喜树，是近年来临床上用于治疗晚期肺癌的新型化疗药物,在美国已被批准用于晚期难治性卵巢癌[1]. 目前国内对TPT的研究报道较少,其抗肿瘤作用机制尚未明确. 丝裂原活化的蛋白激酶(MAPKs)在将细胞外刺激信号转导至细胞及核内的过程中，通过丝/苏/酪氨酸磷酸化，参与细胞增殖、分化、转化及凋亡等及其重要的生物学反应，其中p38 MAPKs主要参与细胞凋亡相关的调控[2]. 本实验我们观察了TPT对体外培养KB细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用,并研究了MAPK信号转导通路pp38的表达,以初步探讨其诱导KB细胞凋亡的机制，为人口腔上皮癌的治疗提供依据.

 

　　1材料和方法

 

　　1.1材料

 

　　Topotecan购自Gene公司，RPMI 1640购自Gibco公司，KB细胞购自上海细胞所，MTT购自Sigma公司，p38一抗、二抗和pp38一抗、二抗及标准分子量蛋白Marker均购自美国Santa Cruz公司，化学荧光显迹液化学荧光发光剂购自美国Pierce公司，预染标准分子质量蛋白Marker购自美国BioRad公司;IMAGINGQUANT数据处理系统由提供.

 

　　1.2方法

 

　　1.2.1MTT实验检测Topotecan对KB细胞毒作用用含小牛血清100 mL/L，青霉素100 u/L,链霉素100 mg/L的RPMI 1640培养基在37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养KB细胞. 0.25 mg/L胰酶消化贴壁KB细胞, 细胞密度为1×107个/L，于96孔培养板内接种100 μL/孔(约800个细胞),培养24 h. 设对照组，给药组加入含有Topotecan 25 mg/L的RPMI1640培养基,每孔100 μL,平行8个孔，孵育12, 24和48 h后弃去培养液,每孔加入200 μL浓度2 g/L MTT培养液培养4 h,弃上清,每孔加入150 μL DMSO,轻度振荡,酶标仪在490 nm条件下测定A值，用空白组调零. 细胞抑制率用下式计算.

 

　　细胞抑制率(%)=A对照组-A实验组〖〗A对照组×100%

 

　　1.2.2WesternBlot测定蛋白磷酸化水平[3]样品处理： 裂解细胞，分离提取蛋白. 根据MTT实验结果选取含有Topotecan 25 mg/L的RPMI 1640培养液培养KB细胞12, 24和48 h后，用冷的PBS洗2次(pH 7.4)，加入适量预冷的细胞裂解液(Tris HCl l50 mmol/L, pH 7.4, 10 g/L NP40, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L Na3VO3, 1 mmol/L NaF, 100 mg/L PMSF, 40 ml/L蛋白酶抑制剂)，冰浴15 min,用吸管将细胞碎片连同细胞裂解缓冲液一起转移至经冷却的Eppendorf离心管中;4℃以15 000 g将裂解物离心10 min，收集上清液，加入SDS加样缓冲液(100 mmol/L TrisHCl pH 6.8, 200 mmol/L DTT, 40 g/L SDS, 2 g/L溴酚蓝，200 mg/L甘油)，沸水浴煮5 min，将样品进行分装，保存于-80℃. 蛋白质定量分析： 用改进的Folin酚法定量蛋白. WesternBlot测定蛋白磷酸化水平. 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳： 根据蛋白质定量分析实验调整样品蛋白浓度，用12%的分离胶、5%积层胶和Tris甘氨酸电泳缓冲液(3 g Tris碱，2 g SDS, 14.4 g甘氨酸，去离子水定容至1 L)室温稳流25 mA电泳20 min，调整稳流35 mA，电泳50 min. 转膜： 用电转缓冲液(4.3 g Tris碱，20.5 g甘氨酸，0.4 g SDS, 300 mL甲醇，去离子水定容至1.5 L)将蛋白转移至NC膜上，稳流250 mA, 90 min. 封闭与杂交： 将NC放入封闭液TBST(25 mmol/L Tris缓冲盐溶液，50 mg/L脱脂奶粉，1 g/L吐温20)中室温封闭1 h. p38和pp38一抗用封闭液按1∶2000稀释，4℃过夜，p38和pp38二抗1∶2000稀释，室温1.5 h，压片成像： 将滤膜上滴加1 mL化学荧光显迹液化学荧光发光剂，待反应1 min用X光胶片压片，凝胶成像系统测定免疫印迹区带的光密度，IMAGINGQUANT数据处理系统分析结果.

 

　　统计学处理： 实验数据用x±s表示，组间差异比较用SPSS软件进行非参秩和检验，P<0.05表示有统计学意义.

 

　　2结果

 

　　2.1不同浓度Topotecan对KB细胞增殖的抑制作用25 mg/L TPT 处理细胞12, 24和48 h后，KB细胞的抑制率分别为(24±9)%, (34±7)%和(45±10)%，与对照相比差异显著(P<0.05)，各组间差异亦有显著性(P<0.05).